Перед экспериментом все реагенты и образцы должны быть уравновешены до комнатной температуры; после переплавки образцы снова центрифугируют и берут надосадочную жидкость для анализа; для реагентов или пробоподготовки смешивайте и избегайте пенообразования; калибровка и образцы рекомендуются для повторного тестирования.

1. Add ple: добавляйте стандартный рабочий раствор в первые две лунки по очереди и добавляйте по две лунки на каждую концентрацию рабочего раствора, 100 мю л каждой лунки. Образцы для тестирования добавляются в другие лунки, 100 мю л на лунку (для концентрации образца выше диапазона испытаний образец разбавляют стандартом и разведениями образца). Микропланшет покрывали пленкой и инкубировали при 37°С. ℃ на 90 мин. Совет: при добавлении образца на дно микропланшета старайтесь не касаться стенок отверстия, аккуратно встряхивайте и перемешивайте, чтобы не образовались пузырьки. Дополнительное время должно контролироваться в пределах 10 минут.

2. Биотинилированное антитело/антиген: сливают жидкость и встряхивают насухо, не промывая. 100 мкл рабочего раствора биотинилированного антитела/антигена немедленно добавляли в каждую лунку, перемешивали, помещали в микропланшет с пленочным покрытием и инкубировали при 37℃ в течение 1 часа.

3. Промывка: встряхнуть жидкость в лунке, добавить по 350 мкл промывочной жидкости в каждую лунку, выдержать 1-2 минуты, отсосать или стряхнуть жидкость с микропланшета и высушить на плотной впитывающей бумаге. Повторите этот шаг промывочной пластины 3 раза. Совет: здесь и на других этапах стирки можно использовать стиральную машину. Каждый шаг мытья имеет важное значение для эксперимента.

4. Ферментный конъюгат HRP: 100 мю л рабочего раствора конъюгата фермента на лунку, перемешивают, покрывают пленкой и инкубируют при 37°С. ℃ в течение 30 минут.

5. Промывка: слейте жидкость из лунки и промойте планшет 5 раз так же, как на шаге 3.

6. Субстрат: добавьте 90 мкл раствора субстрата (TMB) в каждую лунку, хорошо перемешайте, добавьте пленочное покрытие и инкубируйте при 37℃ в течение примерно 15 минут. Примечание: время инкубации должно быть сокращено или увеличено в зависимости от фактического развития окраски, но не более 30 минут. Его можно прекратить, когда в стандартном отверстии появится четкий градиент.

7. Прекращение: Добавить 50 мю л терминирующего раствора в каждую лунку для прекращения реакции. Примечание: порядок добавления терминирующего раствора должен быть таким же, как и в случае субстратного раствора.

8. Чтение: Немедленно измерьте оптическую плотность (OD) каждой лунки при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Считыватель микропланшетов следует открыть заранее, чтобы настроить процедуру тестирования.

9. После эксперимента поместите неиспользованный реагент обратно в холодильник в соответствии с указанной температурой хранения до истечения срока годности.